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免疫分析法在兽药残留分析中的应用

时间:2020-11-09 来源:杜仲新文科普网
 

  近年来,动物性食品的安全性已经成为社会共同关注的公共卫生问题,而兽药残留作为动物源性食品安全性的重要影响因素,已成为人们普遍关注的一个社会热点问题。兽药残留不仅直接对人体产生急慢性毒性作用,引起细菌耐药性的增加,还通过环境和食物链的作用对人体健康造成潜在危害。加强兽药管理和兽药残留分析是控制兽药残留的重要手段。兽药残留的分析方法一般有免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。其中,免疫分析法具有高度的选择性和灵敏度、分析过程简化等优点,有很大的发展前景,本文着重探讨免疫分析法的应用及进展。

  免疫分析(immunoanalysis)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础的新型分析技术。抗原与抗体的初级结合反应遵守质量作用定律,可用著名的Scatchard方程来描述。1959年,美国科学家Yalow和Berson利用125I标记的胰岛素与血浆中的胰岛素竞争有限的抗体,以此为基础建立了胰岛素的放射性免疫测定法,从而开创了免疫分析这一崭新领域,被公认为痕量分析化学方面的重大突破。此后又发展了许多替代(alternative)或非同位素免疫分析法。20世纪90年代初,美国化学学会(ACS)陆续出版了食品和环境中化学污染物免疫分析方面的若干论文集,标志着免疫分析技术作为一种分析手段正日趋成熟并被分析化学界接受。免疫女性癫痫病因是什么学技术作为一种分析手段,已经渗透到兽药残留分析的各个环节,包括样品提取、净化、分离和检测。其高度的选择性和灵敏度使分析过程简化,有的甚至已经不需要前处理过程。目前应用的兽药残留免疫分析技术可分为两个基本类型:①免疫净化法,如免疫亲和色谱法(IAC);②免疫测定法(IAs),如酶免疫分析(EIA)、发光免疫分析(LIA)、荧光免疫分析(FIA)、生物传感器(biosensor)等,一般都作为相对独立的分析方法。还有在此基础上的联用技术,如IAC/HPLC、HPLC/IAC等。

  1 免疫净化法

  免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography,IAC)作为免疫净化法是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术,其基本过程为将抗体与惰性基质(如珠状琼脂糖、键合相硅胶)偶联制成固定相,装IAC柱。当含待测组分的样品通过IAC柱时,固定抗体选择性地结合待测物,其他不被识别的样本杂质则不受阻碍地流出IAC柱,经洗涤除去杂质后将抗原-抗体复合物解离,待测物被洗脱,样品得到净化。IAC通常只需“加样-洗涤-洗脱”一步层析就可使复杂样本中痕量的特定组分得到高度纯化和浓缩,具有特异性强、结合容量大、洗脱条件温和、色谱柱可以方便地再生并重复使用等特点,所以非常适用于复杂样本中痕量兽药残留的分六安癫痫医院排名?离和分析。IAC对待测组分有很强的保留和浓缩能力,免疫后期抗体的亲和常数可达1010 mol/L~1012 mol/L,免疫吸附剂的等温吸附曲线曲率很高,只要加样量不超过IAC的柱容量,在实测样本条件下IAC对组分的保留能力几乎不受样本体积或组分浓度的影响。

  20世纪60年代末,溴化氰活化琼脂糖载体的出现奠定了IAC的发展基础,1987年Van de Water等首次使用IAC净化了肌肉中的氯霉素。Crabbe P等[1]报道,使用IAC净化动物体内的磺胺二甲基嘧啶有很高的回收率(92%~100%)。近年来,李俊锁等对IAC及其在兽药残留分析中的应用进行了探索,以IAC为基础已建立了若干测定阿维菌素和伊维菌素残留的方法。Shen J等[2]试验报道用IAC净化组织中残留的马杜霉素,回收率为76.4%~107.5%,并以此为基础进行酶联免疫吸附试验,检测限分别为肌肉组织1.0 ng/g,肝脏?2.8 ng/g,?脂肪1.5 ng/g,表明这种方法的可行性很高。Horne E等[3]也报道采用IAC净化兔肝脏中的噻苯咪唑(TBZ),以此为基础进行高效液相色谱,使得TBZ的检测更加便利。由此可见,IAC是兽药残留分析中最有效的净化方法之一[4]。随着单克隆抗体技术的发展,IAC在残留分析中定会有更广阔的前景。

  安徽治癫痫医院?2 免疫测定法

  2.1 酶免疫分析法

  酶免疫分析分为均相酶免疫测定法(homogenous EIA)和非均相酶免疫测定法(heterogenous EIA)。1966年Avrameas和Uriel首先将酶偶联于抗原或抗体,1971年Engvall和Perlman创立了酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),属于非均相酶免疫测定技术,是EIA的典型代表,也是兽药残留检测的常用方法之一。一般将抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应,底物显色后用肉眼或分光光度法进行检测。1974年Syvaco又报道了酶放大免疫测定法(enzyme multiplied immunoassay technique,EMIT),属于均相酶免疫分析,开创了酶免疫分析的临床应用。此法的基本原理是在抗体或抗原分子上连接酶分子,进行免疫反应,免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色,用酶标仪测定,由颜色的深浅确定待测物的量。

  目前,兽药残留的ELISA检测方法已经相当成熟[5],其中磺胺类、氯霉素类、苯并咪唑类、同化激素类、苯乙胺(β2-受体激动剂)类药物一般采用抗体包被直接竞争法,氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类药物一般采用抗原包被直接竞争法,β-治疗小儿癫痫病好的药?内酰胺类、喹诺酮类、阿维菌素类、聚醚类和多肽类药物一般采用抗原包被间接竞争法。近两年来,Cooper J等[6]将ELISA应用于吩噻嗪、乙酰丙嗪、氯丙嗪等镇静药的残留检出,兔子肾脏组织中的检测限分别为5,5 μg/kg和20 μg/kg,结果表明这仍然是一种快速的而且灵敏度高的多残留检测方法。Cooper K M等[7]采用ELISA测定对虾中的呋喃唑酮代谢物,检测限为0.1 μg/kg灵敏度较液相色谱法和液质联用法都有很大的提高。在国内,秦燕等[8]采用水解衍生-酶联免疫分析这一新方法,测定了动物肌肉中的呋喃唑酮代谢物,方法是将样品中的呋喃唑酮代谢物3-氨基-唑烷酮(3-amino-2-oxazolidone,AOZ)的蛋白结合残留物经酸水解释放AOZ,经2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,NBA)衍生生成3(((2-nitrophenyl)methylene)-amino)-oxazolidinone (NPAOZ)后,调pH至7.2~7.4,经乙酸乙酯萃取后,以?4 000 r/min?离心100 min,取上层氮气流于30 ℃吹干,并入缓冲液溶解,正己烷脱脂后取下层水相进行NPAOZ的ELISA,结果显示定量检测限为200 ng/kg,回收率在85%以上,此方法可实现其代谢残留的高通量筛选。

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